β-七叶皂甙钠抑制损伤脊髓细胞胶质纤维酸性蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实脊髓损伤后早期应用甲基强的松龙冲击治疗可以减轻脊髓损伤的病理程度，但是近20年未再有突破性进展。
目的：观察β-七叶皂甙钠对脊髓损伤大鼠脊髓神经细胞坏死及胶质纤维酸性蛋白抗体表达的影响。
方法：采用改良Allen撞击方法建立脊髓损伤大鼠模型，将建模成功的180只SD大鼠按照随机数字表法分成3组，每组60只，造模后即刻给药，β-七叶皂甙钠组腹腔注射5 mg/kg β-七叶皂甙钠，甲基强的松龙组腹腔注射100 mg/kg甲基强的松龙，对照组腹腔注射等体积生理盐水。每天给药1次，于治疗后8，24，96 h，治疗后7，14 d 5个时间节点处死实验动物并取损伤段脊髓进行苏木精-伊红染色及免疫组化染色观察脊髓组织坏死神经细胞数及胶质纤维酸性蛋白抗体表达情况。
结果与结论：各组均于治疗后8 h出现坏死细胞且7 d达高峰，14 d时水肿减轻但坏死细胞并未减少，但β-七叶皂甙钠及甲基强的松龙两组同一时间点上坏死细胞数目均明显少于对照组(P < 0.05)；各组胶质纤维酸性蛋白吸光度均随着时间延长而增加，β-七叶皂甙钠组与对照组在96 h内增加快速，而甲基强的松龙组缓慢均匀增加，24 h以内β-七叶皂甙钠组与对照组之间无明显差别，但均低于甲基强的松龙组(P < 0.05)，96 h后β-七叶皂甙钠及甲基强的松龙两组均明显低于对照组(P < 0.05)，7 d后各组均开始缓慢下降。结果表明β-七叶皂甙钠对脊髓损伤大鼠脊髓细胞具有明显保护作用，可通过减少胶质纤维酸性蛋白的表达促进神经功能恢复，在用药2周时间内的效果与甲基强的松龙相似。

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关键词: 组织构建, 组织工程, β-七叶皂甙钠, 脊髓损伤, 胶质纤维酸性蛋白, 细胞坏死

Abstract:

BACKGROUND: The methylprednisolone pulse therapy in early period of spinal cord injury can attenuate the pathological degree of spinal cord injury, however no breakthrough was found within recent 20 years.
OBJECTIVE: To observe the protection effects of sodium aescinate on the nerve cell apoptosis and expression of glial fibriallary acidic protein (GFAP) in the early spinal cord injured rats.
METHODS: Spinal cord injury models were established with the modified Allen’s method in 180 Sprague-Dawley rats, and were randomly divided into three groups, with 60 rats in each group. Immediately after injury, the rats in three groups were intraperitoneally injected with sodium aescinate (5 mg/kg), methylprednisolone (100 mg/kg) and equal saline, respectively, once per day. At 8 hours, 24 hours, 96 hours and 7 days, 14 days after injury, rats were sacrificed and the injured segments were resected for hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining, the nerve cell apoptosis and GFAP expression were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The apoptotic nerve cells were seen at 8 hours after injury and the number of apoptotic cells reached the peak at 7 days, the edema was attenuated at 14 days without less nerve cell apoptosis in all groups, significantly fewer apoptotic nerve cells can be seen in sodium aescinate and methylprednisolone groups compared with the control group (P < 0.05) at each time. The expression of GFAP was increased in the time dependant manner in all groups, the increase was slow in methylprednisolone group but sharp in sodium aescinate group and control group within 96 hours. There was no difference between control group and sodium aescinate group within 24 hours (P > 0.05), which was lower than methylprednisolone group (P < 0.05); after 96 hours, methylprednisolone group and sodium aescinate group were both significantly lower than control group (P < 0.05). Furthermore, the decreasing expression was observed in all groups after 7 days. Sodium ascinate has obvious protection effects on nerve cells in spinal cord injured rats and promotes neurological function through decreasing GFAP expression after injury. The efficacy of sodium ascinate is equal to that of methylprednisolone within 2 hours.

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Key words: spinal cord injuries, escin, methylprednisolone, glial fibrillary acidic protein

中图分类号:

R318

丁勇，吴玉杰，傅智轶，金文杰，胡小鹏，刘兴振. β-七叶皂甙钠抑制损伤脊髓细胞胶质纤维酸性蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.020 .

Ding Yong, Wu Yu-jie, Fu Zhi-yi, Jin Wen-jie, Hu Xiao-peng, Liu Xing-zhen. Sodium aescinate reduces glial fibriallary acidic protein expression after spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.020 .

图/表（结果） 4

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引言

急性脊髓损伤指脊髓遭受到外力打击后导致完全性或不完全性脊髓运动、感觉、括约肌功能障碍等，是脊柱外科领域中一种破坏性极大且极其普遍的疾病^[1-4] 。脊髓损伤多发生在青壮年(男性约占82%)，患者绝大部分是16-30岁的年轻人，该损伤严重威胁着患者的健康、生命，给社会、家庭带来极大的负担。但是并非所有急性脊髓损伤均为完全性横断伤，可能更多是由于原发性损伤处理不当所造成的继发性损害，有时这种继发性损害可能更严重并可造成永久性功能障碍^[5-7] 。各国科研人员对脊髓损伤进行了大量的研究，发现脊髓损伤后脊髓组织系列自毁性介质大量释放导致继发脊髓组织缺血缺氧、水肿、变性和坏死是导致伤后神经功能损害的主要因素，这不因脊髓减压而停止^[5-7] 。因此，如何保护未受伤害的脊髓组织，减少或预防继发性损伤，促进损伤脊髓功能的重建是急性脊髓损伤早期处理的关键^[8] 。除及时、有效地稳定脊柱，解除脊髓压迫，脊髓减压等治疗以外^[9-11] ，早期应用有效药物治疗也不可忽视^[7] 。根据脊髓损伤后病理生理等方面的变化，应用一些药物来提高脊髓对损伤的耐受能力，阻止或者减轻脊髓损伤的某些病理过程，达到减小脊髓损伤程度的目的。研究证实脊髓损伤后早期应用甲基强的松龙冲击治疗可以减轻脊髓损伤的病理程度^[12-14] ，但是近20年未再有突破性进展。目前尚无其他被证实对脊髓损伤治疗具有非常明显疗效的药物。
β-七叶皂甙钠是从七叶树科植物天师栗的干燥成熟种子中提取得到的皂甙钠盐，经冷冻干燥的无菌制剂。其作用主要包括：①改善微循环，有效消除局部肿胀。②清除氧自由基。③抗炎、抗水肿，促进皮质醇类化合物的分泌。所以推断其可能对脊髓损伤后病理改变可以产生较大作用。前期研究发现从实验动物行为学上观察其对脊髓损伤大鼠神经功能具有明显保护作用^[15-19] ，但是其作用机制尚需进一步探讨。本研究观察β-七叶皂甙钠治疗后脊髓损伤大鼠脊髓细胞坏死情况及胶质纤维酸性蛋白表达情况，探讨β-七叶皂甙钠对大鼠脊髓损伤的保护作用。

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材料方法

设计：前瞻性随机对照动物研究。

时间及地点：实验于2010年7月至2013年6月在上海交通大学医学院动物实验室及济宁医学院病理实验室完成。

材料：

实验动物：健康封闭群SD大鼠180只，体质量200-250 g，鼠龄三四个月，雌雄不拘，购自西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SIXK(沪) 2010-0002，使用许可证号SYXK(沪)2010-0012。

实验方法：

大鼠脊髓损伤模型的建立：采用改良Allen撞击方法^[9]建立脊髓损伤模型。腹腔注射氯胺酮-安定-生理盐水混合液(1∶1∶2)，其中氯胺酮50 mg/kg、安定5 mg/kg。麻醉成功后将大鼠俯卧固定于平板上，背部术野剃毛后点尔康消毒。以T₉棘突为中心取后背正中纵切口，长约2 cm，暴露并咬除T₈_，₉棘突及椎板，暴露T₉_，₁₀平面脊髓。自制改良Allen装置，将玻璃套管一端磨成“鱼口形”，使“鱼口形”正好卡在脊髓上贴附良好，保持套管垂直，打击器从10 cm高处垂直落下，造成脊髓中度打击损伤(图1)。缝合肌肉，切口内肌层外敷青霉素粉，关闭切口，术后不限饮水和进食，室温20-25 ℃饲养。

实验分组：将建模成功的SD大鼠按照数字随机表法分成3组，每组60只。对照组：脊髓损伤后即刻给予等体积生理盐水腹腔注射，1次/d，共14 d；β-七叶皂甙钠组：脊髓损伤后即刻给予5 mg/kg β-七叶皂甙钠腹腔注射， 1次/d，共14 d；甲基强的松龙组：脊髓损伤后即刻给予 100 mg/kg甲基强的松龙腹腔注射，1次/d，共14 d。

主要观察指标：分别在治疗后8 h，治疗后1，4，7，14 d进行检测，每个时点每组各12只，处死实验动物并取损伤段脊髓进行光镜及免疫组化染色观察脊髓神经细胞坏死及胶质纤维酸性蛋白表达情况。采用SmartScape自动显微图像分析系统对切片进行组织图像分析，每张切片随机选取6个视野，选择切片的光白区调节灰度，然后对细胞的阳性物质进行二态化图像修正，40倍物镜下用计算机算出吸光度，吸光度代表抗原相对含量，反映染色强度。吸光度越高表示胶质纤维酸性蛋白表达水平越高。

统计学分析：应用SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤常导致残疾等不良结局，严重影响患者的生命质量，其中的大部分脊髓损伤是由于原发性损伤处理不当所造成的继发性损害，其机制主要包括：①血管内皮细胞变性、水肿，小血管破裂，血小板聚集和血栓形成。②电解质紊乱造成神经传导阻滞，细胞内游离钙增加，脂质过氧化，氧自由基增多，导致细胞损害死亡^[10-12，19]。
β-七叶皂甙钠作用主要包括：①改善微循环，有效消除局部肿胀。β-七叶皂甙钠含有多酯键三萜皂苷的钠盐，可提高血浆内促肾上腺皮质激素和皮质类固醇的浓度，导致血糖升高和胰岛素水平降低^[15] ，从而恢复毛细血管正常通透性，改善微循环内的血液淤滞状态，改善组织血供。②清除氧自由基。七叶皂甙钠含有7个羟基，可捕获氧自由基，抑制脂质过氧化反应，具有显著的神经保护作用^[15-17] 。③抗炎、抗水肿，促进皮质醇类化合物的分泌，增加前列腺素F2a的分泌，拮抗前列腺素E1、缓激肽与5-羟色胺等炎症介质，发挥抗炎、抗水肿作用。一方面，β-七叶皂甙钠通过刺激增加前列腺素E1的生理拮抗剂—前列环素的产生来对抗前列腺素E1的致炎作用，另一方面，还可降低炎症反应时被前列腺素E1增大的脑血管壁内皮细胞间隙，在此水平上拮抗前列腺素E1的作用直至内皮细胞间隙恢复正常，从而达到抗炎症和抗渗出的作用^[15-17] 。
甲基强的松龙是一种人工合成的糖皮质激素，可通过多种机制阻止脊髓损伤的发展：①减轻脂质过氧化反应，维持稳定细胞膜完整。②改善损伤段脊髓的血流。③增强中枢神经系统应激性^[20-22] 。
星形胶质细胞是中枢神经系统中的一种主要的胶质细胞，对神经细胞起支持、保护及参与代谢的作用。当脊髓损伤后，星形胶质细胞出现明显的功能活跃及产生反应性胶质化，表现为增生、肥大、突起增多，分泌、释放多种神经诱导因子促进神经再生^[23-24] 。星形胶质细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用具有两重性，即幼稚期的诱导作用和成熟期的抑制作用—当神经纤维再生时，星形胶质细胞增生的幼稚期合成活跃，构成网格框架支持并诱导神经纤维再生；当神经再生不良时，星形胶质细胞则变为成熟期，即变为结构型胶质细胞，对神经再生起到机械阻挡作用^[25-30] 。
胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的标志蛋白，是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白，其表达的高低可以反映胶质细胞功能的状态^[24-27] 。胶质纤维酸性蛋白抗体能使胶质纤维组成的神经纤维网格框架着色，因此可通过此种染色对白质纤维的损伤情况迸行观察。在损伤早期星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白表达高低可以作为衡量脊髓损伤程度轻重的指标之一，即脊髓损伤越重，胶质纤维酸性蛋白抗体表达越高^[27,31] 。以往研究发现其表达有时间依赖性，一般在脊髓损伤5 d内表达持续增加并逐渐达到高峰。随着时间的推移胶质纤维酸性蛋白的表达逐渐下降，一般均会在损伤2周后出现比较明显的下降^[27,30-32] 。
本实验结果显示胶质纤维酸性蛋白抗体吸光度均随着时间延长而增加，β-七叶皂甙钠组与对照组在96 h内增加快速，而甲基强的松龙组缓慢均匀增加，24 h以内β-七叶皂甙钠与对照组之间无明显差别，但均低于甲基强的松龙组(P < 0.05)，96 h后β-七叶皂甙钠及甲基强的松龙两组均明显低于对照组(P < 0.05)，7 d后各组均开始缓慢下降。总体结果与以往报道的脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白表达相似，但也有少许区别：实验各组均显示胶质纤维酸性蛋白表达在脊髓损伤后持续上升，于伤后7 d达到顶峰，与以往报道的5 d左右有少许不同。但是此结果与本实验光镜下每个视野坏死神经元细胞数变化一致，本实验中各组光镜下每个视野坏死神经元细胞数也是在7 d内持续上升并于伤后7 d时间节点达到顶峰。β-七叶皂甙钠组与对照组在 96 h内快速增加，而甲基强的松龙组缓慢均匀增加，24 h以内β-七叶皂甙钠及组与对照组之间无明显差别，但均低于甲基强的松龙组的结果表明虽然β-七叶皂甙钠与甲基强的松龙对于大鼠脊髓损伤都有明显的保护作用，但是产生作用的时间、持续的时间存在明显差异：在脊髓损伤后应用β-七叶皂甙钠24 h内，其对于脊髓损伤的保护作用并不明显，但是随着使用时间的延长，可以发挥明显的脊髓保护作用，甚至在脊髓损伤后7-14 d之间其对脊髓的保护作用已与甲基强的松龙无明显差别，而且 14 d后该作用仍然明显，这说明β-七叶皂甙钠作用缓和、持久。相反，甲基强的松龙在脊髓损伤很早期就开始产生明显作用，但是发挥作用的持续时间不是很久，在96 h以后其作用开始缓慢减弱。
实验总体结果显示，β-七叶皂甙钠对于大鼠急性脊髓损伤具有明显的保护作用，其在脊髓损伤后2周内其对神经的保护作用与甲基强的松龙相似，但是其作用更缓和、持久。至至于其对脊髓损伤的保护作用具体机制如何，以及应用药物的浓度及模式或者对于其他药物的联合使用是否会加强该神经保护效果需要进一步深入研究。

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